…冷凍胚胎 凍卵 看評論

玻璃? 什麼是玻璃化冷凍?

{What is Vitrification?}

更新時間:2009-07-16 by Ashley

「胚胎最多只能植入四顆,其他要冷凍起來?」
「玻璃化冷凍? 那是啥東東? 玻璃?」

在臨床上,許多剛開始接觸到這名詞的客戶們,心中都充滿著疑問。胚胎真的能像食物一樣經得起冷凍解凍嗎? 那什麼叫做當今最流行的「玻璃化冷凍」呢?

玻璃化冷凍的原理

玻璃化指的是一種介於液態與固態之間的狀態,在此型態中,沒有任何晶體結構的存在。一直以來,不論在冷凍任何細胞的過程中,最怕的就是細胞內的水分形成體積較大的冰晶,而因此破壞了細胞內的胞器、紡錘體或細胞骨架,進而影響細胞正常功能,嚴重時會使細胞無法存活。玻璃化冷凍(Vitrification),是利用高濃度的冷凍保護劑,在短時間內置換掉細胞內的水分,接著以非常快的速度(約2000℃/每分鐘)進行降溫,使細胞內的液體變成類似高粘稠、高濃度的玻璃化物質,來減少冰晶所造成的傷害。

1. 圖解玻璃化冷凍(可點選箭頭觀看圖片)

 

2. 圖解玻璃化解凍(可點選箭頭觀看圖片)

 

玻璃化冷凍技術與傳統慢速冷凍的比較

以往的冷凍方法多是利用慢速冷凍(Slow freezing),方式是緩慢增加冷凍保護劑的濃度,在程式化系統梯度降溫及利用『人工植冰』(seeding)控制結冰方向,慢慢使細胞外水分相對減少、電解質濃度相對增高,而逐漸置換掉細胞內的水分,使其盡量完全脫水。兩種冷凍方法各有其優缺點,比較如下表,也由於玻璃化冷凍略勝一籌,送子鳥皆已全面採用玻璃化冷凍解凍技術來替客戶保存囊胚期胚胎,臨床上也顯示懷孕率與新鮮週期植入相當或甚至更好,已成為目前冷凍技術的最佳選擇。

  慢速冷凍 (Slow freezing)玻璃化冷凍 (Vitrification)
優 點
  1. 冷凍保護劑濃度較低,對細胞毒性較小
  1. 省時,流程約3-5分鐘,因要快速降溫,使其產生一個完全無結冰的冷凍過程
  2. 步驟較簡單
  3. 較節省液態氮,不需昂貴儀器、較節省費用
缺 點
  1. 過程較費時,超過2小時
  2. 消耗較多的液態氮
  1. 高濃度的冷凍保護劑對細胞毒性較大,需盡量縮短操作時間
  2. 細胞周圍的冷凍保護劑體積越小越好,需具備熟練操作技術
解凍存活率 91.4% 95.9%
解凍懷孕率 42.8% 48.7%

Ref.:Tucker,254 cycles,2006

 

表一:Tarlatzis, 2008

玻璃化冷凍解凍的重要因素

胚胎玻璃化冷凍與解凍是否成功,主要的條件有下列幾點:

  1. 胚胎本身品質的好壞:冷凍前胚胎的品質越好,解凍後存活率較高,未來的流產率較低。
  2. 降低高濃度冷凍保護劑對細胞造成的毒性,操作時間需控制得當。
  3. 操作上是否提供急速降溫、無結冰的冷凍過程:因需要急速降溫,包含胚胎及些許冷凍保護劑的總體積越小越好,而這時最重要的就是裝載具(Carrier)。目前常用的有straw、OPS(Open pulled stra)、cryotop、 cryoloop...等,每項載具皆有許多論文發表,但各有各自的優缺點,目前送子鳥所使用的是cryotop,體積最小可至0.1μl,最高的降溫速度約每分鐘23000℃,而升溫速度約每分鐘42100℃。

載具最小體積(μl)降溫速度(℃/min)升溫速度(℃/min)
Straw 25 2500 1300
OPS 1 16700 13900
Cryotop 0.1 23000 42100
Cryotip 1 12000 24000

Ref.:Vitrification in Assisted Reproduction,Table 7B.3

 

玻璃化冷凍技術的應用

在2009年1月的台灣生殖醫學會繼續教育中,將玻璃化冷凍應用在囊胚期胚胎、分裂期胚胎、卵子或精蟲等配子細胞的文獻加以整理與分享。

自從培養技術精進後,培養至囊胚期胚胎慢慢成為目前的主流,主要因為可藉由觀察跨至囊胚期的胚胎型態,試著找出品質最好的胚胎,以期不要植入過多胚胎造成多胞胎的機會。而囊胚期胚胎的玻璃化冷凍技術,主要的技巧在於,囊胚期胚胎體積較大,更需要完全脫水,因此在高濃度冷凍保護劑外,還需加上一點物理性的刺激,而盡量減少冰晶的物理性傷害。

針對仍在分裂的分裂期胚胎,有研究指出,若要進行冷凍過程,最好是選擇2n的細胞來進行冷凍(如2細胞、4細胞、8細胞時期),由於單細胞時期(如3細胞、5細胞、6細胞等)可能正值細胞分裂階段,胞內紡綞絲、染色體活躍,較容易被冷凍過程傷害,而造成解凍後存活率不如預期。

發展卵子冷凍的過程中,相同地最大的挑戰為卵子是目前最大體積的細胞,整個細胞內的胞器運作複雜,在這個時期應該如何確保冷凍解凍後,細胞工廠仍能正常運作。利用玻璃化冷凍解凍技術,跟慢速冷凍相比,發現細胞在解凍後紡綞體的恢復速度較快,也大大增加了卵子的存活率、受精率。


精選文章:冰過的也不錯!使用新穎方式冷凍保存卵子及女性生育力

另一個重要的配子-精蟲,也可以利用玻璃化冷凍技術,但是由於精蟲數目及精液體積較大,目前仍多採用冷凍小管慢速冷凍的方式進行保存。


精選文章:比較慢速冷凍法與無抗凍劑直接玻璃質化冷凍 人類精蟲DNA完整性與活動力的差異

 

玻璃化冷凍會不會影響出生寶貝的健康?

當寶貝胚胎要進行冷凍之前,媽咪們都會擔心地詢問,會不會影響寶寶未來的健康或發育。2006年日本學者Takahashi搜集了六年冷凍解凍後植入而出生的寶寶,發生先天性缺陷的機率與新鮮胚胎植入相近(約2~2.7%),並不會因為冷凍解凍的過程增加。不論是否為解凍或新鮮植入,甚至於自然懷孕的準媽咪們,都建議能在16~20週時進行羊水篩檢,若是較高齡的產婦,更是可以提早在10~11週進行絨毛膜採樣,讓孕期更安心。

Takahashi, 2005新鮮囊胚植入玻璃化冷凍解凍囊胚植入
總共出生嬰兒數 205 147
出現先天上缺陷 4(2%) 2(1.4%)

 

送子鳥目前玻璃化冷凍的專業技術,冷凍解凍懷孕率與新鮮植入相當

「在什麼情況下,需要把胚胎冷凍起來呢?」

結束一次辛苦的試管嬰兒療程,每一顆得來不易的胚胎都不想浪費,但在多胞胎率與懷孕率的蹺蹺板間,如何取得一個平衡呢? 通常醫師會建議植入一至二個好胚胎,而剩下的胚胎則冷凍起來,當未來想再帶回第二個寶寶時,可再進行解凍植入即可,不用再重新施打排卵針。若不幸這次沒有成功懷孕,也可以直接解凍,給自己再一次的機會。

另外,在打排卵針的過程中,抽血監控體內荷爾蒙濃度時,可能發現有卵巢過度刺激(OHSS)的風險、或是想盡量抓住子宮內膜與胚胎的最佳謀合時間,醫生依狀況與經驗,也會建議此週期不植入,將胚胎冷凍起來,等待另一週期,經過內膜調整後再解凍植入,在臨床上,成績也非常不錯。玻璃化冷凍無非是提供了一個很好的選擇,讓辛苦的打針週期稍作休息,待下次準備好後,再迎接胚胎入住。

第一例人類囊胚期玻璃化冷凍解凍的小寶寶,在2000年健康的誕生,從此開 始了玻璃化冷凍技術的蓬勃發展,全世界至少已經有上萬名經冷凍解凍所出生的小寶寶了。日新月異的生殖醫學,為我們帶來了如今的玻璃化冷凍技術,而相信國內外的生殖醫學專家,仍不斷地研發更新、更適用的技術,未來將幫助更多不孕的夫妻們完成心願;而在配子(卵或精蟲)的保存上,不論是事先保健預防的觀念,或是替癌症病人完成延續生育力的心願,玻璃化冷凍技術的應用,也讓配子的冷凍保存提供了更好的選擇。

參考資料

  • Juergen L, Michael J. Tucker Ph.D. Comparison of vitrification and conventional cryopreservation of day 5 and day 6 blastocysts during clinical application. Fertility and Sterility. 2006,86 (1): 20-26.
  • Kalliopi E. Loutradi M.Med.Sc, Efstratios M. Kolibianakis M.D., Ph.D., Christos A. Venetis M.D., M.Sc, Evangelos G. Papanikolaou M.D., Ph.D., George Pados M.D., Ph.D. Ioannis Bontis M.D., Ph.D.a and Basil C. Tarlatzis M.D., Ph.D. Cryopreservation of human embryos by vitrification or slow freezing: a systematic review and meta-analysis. Fertility and Sterility. 2008, 90(1):186-193
  • Michael J Tucker, Juergen Liebermann. Vitrification in Assisted Reproduction. p135 Table 7B.3
  • Imam D., D.V.M. and Helmy Selman Ph.D. Successful pregnancies and deliveries after a simple vitrification protocol for day 3 human embryos. Fertility and Sterility. 2001, 76(2):400-402
  • K. Takahashi., T. Mukaida, T. Goto and C. Oka. Perinatal outcome of vitrified human blastocysts in 6 year experience (1305 transfer cycles). Fertility and Strerility. 2006, 86(3), Supplement 1:S64
  • Vitrification Kit Cryotop Method. KITAZATO Biopharma Co.

賴興華 醫師的分享

評語圖片
  1. 玻璃化冷凍保存技術的突破性進展,已將試管嬰兒治療再往前推進一大步,從前許多面臨要不要植入的兩難狀況,目前都找到了出口,例如有卵巢過渡刺激疑慮者、血液賀爾蒙E2太高者、卵泡過早黃體化者、有免疫性不孕疑慮者、胚胎分裂數度較慢者、臨時發現陰道炎或感冒者、或者基於分散風險考量者...等等狀況,都可將胚胎先冷凍保存,等待適當時機解凍植入。
  2. 玻璃化冷凍技術的訣竅在冷凍的「速度」與「體積」,速度越快體積越小成績越好,冷凍速度最快可達130 x 103 ℃/Min,體積最小可達0.1ul,速度只要每分鐘達2000℃以上成績都差不多,體積則還有改善空間。
  3. 送子鳥全面引進此技術兩年,目前的經驗是成績至少已達新鮮胚胎植入水準,如果考量凍胚多是新鮮植入挑剩的,則成績明顯高於新鮮胚胎植入,此項技術搭配囊胚期胚胎植入,已經使得試管嬰兒只要取卵兩次,每次有「十顆卵子」,就有四次植入機會,實現「取卵兩次接近百分百懷孕率」,換句話說,只要給我們兩次取卵機會,幾乎所有客戶都可順利領到畢業證書。
  4. 期待這項技術能早日用在卵子冷凍保存,這樣對新興人類「敗犬」女人會是一大福音。最新的研究冷凍卵子之存活率已經高達九成,受精率達六成,臨床懷孕率達三成。(Fertility & Sterility 2008;90 supp 1:S291~2)
  5. 感謝生殖中心Ashley百忙中用心分享最新生殖科技,創新研發與持續學習使我們成長與快樂。
  6. 註:「敗犬」女人是指30歲以上,事業(工作)有成但未婚之女性,請參考電視劇「敗犬女王」。